富血小板血浆疗法(PRP)有助于软组织、骨组织的修复。修复过程中血小板聚集与间充质干细胞增值、成纤维细胞的增值以及Ⅰ型胶原的产生等密切相关[1]。期间血小板激活分泌的信号蛋白密切相关[2,3]，有助细胞趋化、细胞增殖因子、诱导分化等，可移除组织碎片，使血管再生，为组织修复提供平台[2,4]。近5年国外PRP疗法的主要运用于运动员软组织损伤、整形外科、脊柱外科、皮片移植术等情况。搜索Pubmed近5年以PRP为主题的文献中，应用最多为骨关节疾病(26.69%，/)，其次为颌面部手术(5.08%，64/)，其他部位皮肤创面愈合和皮瓣移植术(4.53%,57/)，牙周疾病(3.97%,50/)等。国内PRP研究以动物实验研究为主，人体运用尚未普遍开展。以上研究均为临床PRP运用提供充分依据，但对血小板参与组织修复相关的生物机理、在损伤修复的作用，PRP的配制、优点、临床运用尚未全面了解。本文将针对上述不足及在骨关节临床的运用具体阐述。1血小板在组织修复相关生物机理及其修复作用1.1血小板形态学及作用血小板中包含线粒体、微管、颗粒(α,γ和λ三种)等细胞器或结构[5]。在成熟巨核细胞胞质碎片形成的血小板中，每个血小板中α颗粒含量在50-80个，可分泌30多种生物活性蛋白，在组织修复中起主要作用[6]。血小板内有开放的微管系统，增加有效接触面积，接受激动剂，释放有效分泌物。1.2血小板在组织修复初期(凝血途径激活)的作用血小板主要参与凝血和组织修复。而凝血过程又是组织修复的基础(图1)。组织损伤后，局部毛细血管被破坏，血小板游离出并聚集在组织损伤部位、形成伪足，毛细血管破损由胶原纤维暂时连接填补[5]。粘附在组织损伤部位的血小板内α颗粒向胞膜趋近，通过胞吐作用释放出α颗粒内的各种生长因子修复组织。已破坏血管，缺损较小者由血小板栓子填补，较大者由血栓填补。此外，血小板、凝血酶等释放的ADP也参与修复因子激活。图1凝血途径中血小板的作用[7]1.3血小板在组织修复的作用组织修复过程包括三个阶段：(1)炎症；(2)增生；(3)重塑[8]。炎症期形成的肉芽组织为增生期组织进一步修复提供物质基础，此外还需要生长因子，间充质干细胞分化成各组织细胞，周围组织适当的pH及氧张力。最后阶段形成瘢痕组织，软组织的瘢痕组织形态不同于原组织，但只要含有足够原组织成分，就可以逐渐(数年)修复为原组织形态；修复骨组织与原组织无明显形态学变化[9]。不同组织、患者体质、各种治疗均会影响修复进程和质量。组织修复过程中，血小板中的α颗粒释放的生物活性因子主要包括：转化生长因子(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)(包括β1,β2两个亚型)，血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)(αα,ββ和αβ三个亚型)，血小板因子4(plateletfactor4,PF4)，白介素1(interleukin,IL-1)，血小板衍生内皮生长因子(platelet-derivedendothelialgrowthfactor,PDEGF)，血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)，血小板衍生血管生长因子(platelet-derivedangiogenesisfactor,PDAF)，上皮细胞生长因子(epithelialcellgrowthfactor,ECGF)，胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor,IGF)，骨钙素(osteocalcin)，骨连接蛋白(osteonectin)，纤维蛋白原(fibrinogen)，玻连蛋白(vitronectin,Vn)，纤维连接蛋白(fibronectin)和血小板反应素(thrombospondin,TSP-1)[10-12]。血凝块形成后约10分钟，α颗粒在1小时内可释放出95%生物活性因子，经胞吐后在组蛋白和碳水化合物支链的作用下活化，与靶细胞(如：间充质干细胞、成纤维细胞)跨膜受体在细胞膜外表面结合，引起胞内蛋白信号激活，再通过第二信号诱导靶细胞内基因表达的改变，产生细胞增殖、基质形成等效应[4]。例如PDGF可促使巨噬细胞趋化；PDGF、TGF-β和IGF可促进间充质干细胞有丝分裂；PDAF促进毛细血管向组织内生长[13]。图2血小板在组织修复中的作用[7]MSCs：间充质干细胞，PDGF：血小板衍生生长因子，TGF-β转化生长因子。2PRP对损伤组织的作用PRP为自身全血血浆经分离制备后得到的含高浓度血小板及少量其他成分的血制品[14]。PRP中除高浓度血小板还包含完整的正常浓度凝血因子，并保持生理活性。以下五项因素影响PRP中血小板修复作用：血小板浓度比，制备技术，分泌性蛋白浓度定量，制备后的处理及应用及临床运用方法。2.1血小板浓度比血肿作为对组织损伤的反应，血肿大小与组织损伤程度成比例。同理，PRP可视为血肿正常产生量的额外部分。因此，PRP的作用可能与组织损伤程度和类型、血小板浓度及PRP体积分数有关。现报道的PRP使用浓度从小于2倍至8.5倍不等[4,15-19]，有研究认为PRP应达到正常血小板浓度的3-5倍能达到最佳临床疗效[17,18]。钟达等[20]观察不同体积分数的富血小板血浆对犬骨髓间充质干细胞增殖的影响，将制备好的PRP加入含青霉素、链霉素的无血清低糖DMEM培养基分别稀释成5%，6.25%，7.5%，8.75%，10%共5个体积分数，放入培养箱6天后6.25%PRP组细胞数量增殖最多。2.2制备技术目前PRP主要通过离心分离法制备，在离心过程中通常混合抗凝枸橼酸葡萄糖溶液，防止血小板在离心过程中破碎，将离心后的PRP与凝血酶-钙剂以10:1混合制成自体富血小板凝胶(autologousplatelet-richgel,APG)及释放物[7]。国内在离心技术上研究较丰富。卢萌等[21]研究四种离心方法(方法一：一次离心力g，二次离心力g；方法二：一次离心力g，二次离心1g；方法三：一次离心力1g，二次离心力g；方法四：一次离心1g，二次离心力1g)对PRP浓度及活性的影响，离心时间均为10分钟，以血小板计数、归一化血浆P选择素浓度作为PRP活性指标，最后得出方法二为最佳制备方法(血小板计数最高，归一化血浆P选择素浓度最低)。罗涛等[22]研究不同抗凝剂和激活剂联合(依地酸钠钙-凝血酶组，依地酸钠钙-Ⅰ型胶原组，肝素-凝血酶组，肝素-Ⅰ型胶原组)应用对富血小板血浆凝胶释放生长因子影响，结果得出依地酸钠钙与Ⅰ型胶原制备的富血小板血浆凝胶所释放生长因子的浓度较大。目前国内采用二次离心分离，该方法容易受到外界污染，多个容器中转移，增加了血小板激活和被污染的机会；血小板回收率相对较低；易受操作因素的影响，制备方法不够稳定；没有专门的应用工具，使用不方便[23]。有研究显示该套装制备出的PRP中平均血小板和白细胞浓度分别为(.47±.32)×L-1和(32.2±10.42)×L-1，分别是全血计数的(6.4±1.06)倍和(6.1±1.93)倍[23]。图3富血小板血浆产品图中a,b为套装内产品组成，c为产品带包袋。2.3分泌性蛋白浓度定量分泌性蛋白浓度水平受以下影响：(1)PRP中分泌性蛋白浓度；(2)制备技术，制备过程中是否血小板被激活或者破碎；(3)在测量血小板前是否完全激活[15,16,19,24]。在测量前必须确保分泌性蛋白完全释放，可用物理方法或氯化钙加凝血酶体外启动凝血过程，临床当PRP在体外应用或将PRP做止血剂或组织包埋的媒介时常用该方法。Weibrich等[24]用冷/热循环法(freeze/thawcycle)释放分泌性蛋白，测得例患者PRP分泌蛋白量(PDGF-αβ，PDGF-ββ，TGF-1，TGF-β2，IGF-1)分别为.5±63.4ng/ml，9.9±7.5ng/ml，.4±84.5ng/ml，0.4±0.3ng/ml和84.2±23.6ng/ml。Eppley等[16]测得分泌性蛋白浓度分别为17±8ng/ml(PDGF-ββ)，±42ng/ml(TGF-1)，±ng/ml(VEGF)，±61ng/ml(EGF)和72±25ng/ml(IGF-1)。2.4制备后的处理及应用未激活的PRP、激活后PRP释放物等都是液态的，可以注射用，并且未激活的PRP可以通过人为添加氯化钙或凝血酶控制凝集时间使之在到达靶向部位后再形成凝胶，从而达到使生长因子缓释的目的，在制成后8小时以上仍可使用，适合长时间手术。由PRP经血小板激活制成的血凝块在骨关节疾病的使用逐渐开展(图4)。Marx研究显示血凝块制剂须在制成后10分钟内使用[4]。图4将血凝块植入半月板损伤部位(A)塑料推棒将血凝块推入插管内(B)血凝块被移植到关节腔内损伤部位[25]2.5临床应用有研究者认为PRP可加速骨组织、软组织修复，减少术中失血和术后感染机会，减轻术后创面疼痛[7]。目前PRP主要运用于骨关节疾病(骨性关节炎[26-28]、肱骨外上髁炎[29]、骨坏死[30,31]、骨不连[32,33])、颌面手术[34]、整形美容手术[35]、创面愈合手术[36]、脊柱融合术[37]、牙周和口腔手术[38]等。3PRP在骨关节疾病的运用PRP在国外主要运用于骨关节疾病，人体研究已涉及肌腱韧带等软组织损伤及关节软骨、骨组织损伤。国内运用于人体的PRP初步上市，尚未广泛开展人体研究。3.1骨性关节炎意大利MarcelloNapolitano等[39]将27例门诊膝关节痛患者分为2组(关节炎组和骨关节炎组)，进行为期1年的PRP治疗(每周3次)。用NumericalRatingScale,NRS和McMasterUniversitiesOsteoarthritisIndex,WOMAC在治疗前、治疗后7天及6个月进行连续7天的评估。结果得出治疗后7天及半年后骨关节炎较关节炎疼痛和膝关节活动度有明显改善。韩国JaewooPak[40]对2例右髋关节退变导致右膝关节疼痛患者(79岁女性，70岁女性)进行个案报道，均使用PRP混合透明质酸、氯化钙、地塞米松进行右髋关节腔内注射，对2例仅右髋关节退变患者(29岁女性，47岁男性)使用PRP混合透明质酸和氯化钙行右髋关节腔内注射。结果MRI发现关节软骨再生迹象，物理检查显示关节活动度改善，疼痛减轻。提示PRP对骨性关节炎是微创而有效的疗法，且在国外较其他治疗花费少。3.2骨坏死(osteonecrosis,ON)ElisabettaCenni等[41]将18例皮质类固醇激素相关性股骨头坏死患者与18例特发性股骨头坏死患者纳入治疗组，将44例健康人作为对照组。经2周PRP关节腔注射治疗后测患者PF4、TGF-β1、PDGF-ββ和VEGF。结果发现特发性ON患者(平均%)较对照组患者(平均%)纤溶酶原水平更高，皮质类固醇激素相关性ON较对照组有更高的D-二聚体(治疗组ng/mL，对照组ng/mL)和较低的C反应蛋白(治疗组%，对照组%)水平(P0.05)。治疗组与对照组相比PF4(治疗组IU/mL，对照组IU/mL)和PDGF-ββ(治疗组3.1ng/mL，对照组2.2ng/mL)水平较高(P0.05)。治疗组两类患者间各指标无明显差异。提示PRP可作为骨坏死修复的有效辅助治疗方法。3.3骨不连PRP在骨不连的运用以制作支架材料为主。曲志国等[33]在进行脐带源间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)移植时，选用了富血小板血浆及脱矿骨粉作为支架材料。脱钙骨可在骨不连修复过程中发挥传导成骨作用，其结构及组成类似人体骨组织，符合骨修复的生理要求，具有良好的生物相容性，是理想的骨组织工程支架材料，可促进脐带源MSCs发挥成骨效应，达到治疗骨不连的目的。3.4肌腱韧带病变PRP对肌腱韧带疾病研究在国内外仍以动物实验为主，存在少数个案报道。YutakaMorizaki等[42]研究PRP和骨髓基质细胞(bone-marrowderivedstromalcell,BMSC)对狗指深屈肌腱的修复作用。对照组将损伤肌腱简单缝合，A组贴上含PRP的贴片，B组贴上含BMSC的贴片，C组贴上含PRP和BMSC的贴片。在治疗第2周和第4周分别对其最大断裂强度和刚度测试，发现PRP联合BMSC贴片对肌腱损伤恢复最有效(P0.05)。DimitrisLyras[43]将48只新西兰白兔均分为两组，造成髌腱损伤模型，治疗组用PRP凝胶填充缺损处，对照组未使用PRP。在治疗后1、2、3、4周用免疫组化染色测定CD31抗体，PRP组较对照组明显修复较快，第3周时PRP组可见髌腱组织虽缺乏弹性胶原纤维，但生长较对照组更成熟、致密。脉络膜新生血管PRP组较对照组明显增殖再生，且前两周较后两周更明显(P0.05)。4PRP临床运用优势目前，PRP已在国外广泛运用与组织损伤，并可以根据不同组织类型、发病机理，制成不同剂型，或以某种生长因子为主要成分的血小板浓缩物进行某种疾病的靶向性治疗。PRP的有效性可以持续较长时间，直至血凝块被自身清除、代谢[7]。中国医疗产品市场上PRP在美国已经获得FDA认证，在应用上具有权威性。PRP作为产品具有以下优点：①PRP是自源性的，这从根本上避免了外源性生长因子引起免疫排斥，传播疾病以及异种重组基因产品可能改变人类遗传结构的担忧，具有安全性。②PRP含有大量的纤维蛋白，可以粘合骨折块和人工骨颗粒，且为修复细胞提供良好的支架，还可以收缩创面。③PRP可用凝血酶凝固成胶状，敷于伤口，不仅提供了湿润的环境，有利于伤口愈合生长，还可以使生长因子长时间局限作用于伤口处，避免了目前广泛应用于临床的液态重组生长因子试剂在伤口易流失、易蒸发的缺点等。④PRP中还含有大量高浓度的白细胞，可以防止感染。⑤PRP能增加自体骨和人工骨的界面效应，使之更好地结合。⑥PRP的应用可减轻术后出血，减轻疼痛，减少术后并发症。⑦PRP制作简单，对患者创伤小，约20～30min即可完成等。5PRP推广运用存在的问题目前PRP的临床运用还存在以下问题：①因PRP对各疾病尚无明确治疗指南，临床运用方法混杂，未出现大样本、多中心的随机对照试验，所以部分学者对PRP的治疗效果仍持怀疑态度[44]。②虽然PRP已广泛运用在国外整形外科、创口愈合手术和部分骨关节疾病，且有一定有效性，但不同组织、不同病因所需相应生长因子类型、浓度均可能不同，目前还不能确定针对性的明确PRP浓度，所需生长因子及其浓度，以及相应的治疗时机、频率、剂型[7]。③不同个体对PRP浓度比的需求不同，只有制备出合适的浓度比才能使PRP发挥最大的生物效应，目前尚无方法衡量个体所需的血小板浓度比[34]。④PRP中不同生长因子也存在相关性(如：PDGF-ββ和PDGF-αβ，PDGF-ββ和TGF-β1，PDGF-αβ和TGF-β1[24])，这些相关性是否影响增加某种生长因子浓度的靶向性治疗尚无定论。⑤PRP使用的主观性较大，医生根据个人治疗经验将PRP与常规使用注射剂(如透明质酸酶注射液、糖皮质激素等)混合使用，虽显示其有效性，但因混合使用的安全性未知，PRP最佳浓度尚未确定，有效混合比例未知，治疗还欠严谨。⑥虽然国外报道PRP产品叫廉价，但国内PRP产品价格较高，目前国内外均缺乏PRP经济-效益比率(cost-effeciacyrate)。
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