大多数多细胞生物具有称为体腔的结构，主要用以分隔重要器官。在早期的原生动物中，体腔内有称为腔细胞的免疫细胞。原始物种如紫海胆（Strongylocentrotuspurpuratus）中的腔细胞具有吞噬细胞功能，可清除毒素和病原体，对组织修复也至关重要。腔细胞的组织修复功能需要钙依赖的稳定细胞-细胞黏附的形成，这在功能上类似于具有血液循环系统的生物体在损伤部位的血小板。
哺乳动物的体腔主要分为三个部分：腹膜，胸膜和心包膜。所有这些腔体均具有驻留的巨噬细胞群，其特征在于转录因子GATA6的表达，可将其称为GATA6+腔巨噬细胞。这些腔巨噬细胞因其吞噬功能而广为人知，并具有形成自由漂浮的团块或聚集体以固定细菌的能力。此前的研究描述了腔巨噬细胞定位和修复体腔内损伤的作用，但尚不清楚这些悬浮在流体相（即腹膜液）中的腔细胞识别损伤并迅速迁移到损伤部位的机制。本文指出，GATA6+腔巨噬细胞是血小板的血管外对应物，可快速形成的血栓样结构对损伤作出反应（其速度可与相邻脉管系统中血小板血栓形成的速度相媲美）。GATA6+腔巨噬细胞的聚集取决于原始的清除受体域，可物理性密封损伤并促进局灶性病变的修复。但当产生更为复杂的损伤时（如医源性手术导致的损伤），腔内巨噬细胞会形成大量聚集体，这些聚集体会促进腹腔内瘢痕组织的生长（即出现腹膜粘连），腹膜粘连定义为在非解剖位置附着腹部结构的不可逆的疤痕组织带，可导致致命性肠梗阻的发生，是腹部手术患者的主要健康负担。
1.GATA6+腔巨噬细胞的成像
为了研究GATA6+腔巨噬细胞响应损伤的迁移机制，该课题组使用了多光子显微镜和极其灵敏的混合探测器，通过完整的腹壁对腹膜腔成像（IVM）。分隔腹直肌（中线）的中线区域提供了自然的成像窗口，腹壁通过形成一个小袋而被固定（图1，A和B）。袋对腹膜腔的其余部分保持开放，从而维持腹膜液的对流，并且器官可以在该空间内移动，仅腹壁被固定。该模型称为“开袋模型”，保留了腹膜液的动力学特性。
快速（8kHz）共振扫描可跟踪快速移动的腹膜巨噬细胞（通过F4/80抗体对其进行染色，F4/80是一种高表达于巨噬细胞表面的糖蛋白）。这些GATA6+腔巨噬细胞在腹膜液中自由漂浮，具有很高的流动性（图1C）。在开袋模型中，激光损伤的部位在数分钟内被数百个腔巨噬细胞覆盖（图2D）。值得注意的是，腔巨噬细胞似乎在损伤部位形成紧密的多细胞聚集体。
图1腹膜开袋模型与GATA6+腔巨噬细胞在流动条件下的IVM成像
2.GATA6+腔巨噬细胞的募集
由于与血小板募集基本相似，该课题研究了巨噬细胞募集是否需要流体的剪切流动作用参与。该课题构建了一个相对腹膜腔密封的腹膜袋（图2F）。尽管密封小袋中有大量巨噬细胞，但腹膜液流动的缺失却消除了GATA6+巨噬细胞的聚集体形成。在密闭袋模型中，从悬浮液转移到损伤部位的细胞明显减少，这证实了腔巨噬细胞依靠腹膜液的动态流动进行被动转运来募集它们（图2F）。
腔巨噬细胞的募集与嗜中性粒细胞的典型募集显著不同，嗜中性粒细胞从血管中出来并以定向的方式爬行穿过间质组织到达受伤的腹壁部位（图2H）。此外，嗜中性粒细胞的募集时间（40分钟）比腔巨噬细胞（1-15分钟）要慢得多（图2，D和H）。
图2GATA6+腔巨噬细胞和嗜中性粒细胞的募集
作者还使用共振扫描模式跟踪了流体相中的GATA6+腔巨噬细胞：这些细胞在未发生接触时具有圆形外观，但在接触后则呈现了细长的上皮表型（图3K），并形成了稳定的附着力，能够抵抗高达dyne/cm2的流体切应力。损伤发生后，腔巨噬细胞的细胞-细胞聚集体覆盖了间皮的破裂处（图3L），但并没有无限期地生长，损伤大小与30分钟后附着的细胞数量之间有很强的相关性。因此，募集巨噬细胞是一个受管控的两步过程：首先，使游离巨噬细胞束缚于损伤，然后，其他巨噬细胞形成这些已经附着的巨噬细胞的次级系链。在此募集过程的任何一步都看不到明显的趋化行为。
图3损伤修复过程中GATA6+腔巨噬细胞形态变化以及聚集体的形成
3.GATA6+巨噬细胞类似于血管外血小板
在损伤部位剪切作用下快速形成聚集体的能力使人联想到血管壁受损后血小板聚集和血栓形成。为了进行比较，作者用CD49b抗体对血小板进行荧光标记，并以激光对上腹部血管壁产生相同的热损伤。跨内皮损伤引起血管内血小板凝集，这与跨膜损伤后的腔巨噬细胞凝集高度相似（图4，A至C）。通过对血小板表达的组成性黄色荧光蛋白（CD41-YFP）和腔巨噬细胞表达的糖蛋白F4/80进行示踪，将两者直接进行头对头比较：跨脉管系统（跨内皮）和跨腹膜壁（跨间皮）引起的热损伤导致在损伤的一侧形成血管内血小板血栓，在另一侧形成巨噬细胞聚集体（图4D）。然而，血小板和巨噬细胞在任何阶段都保持着它们各自隔室中的定位，并不相互混合，但两者的动力学非常相似，15分钟后血小板和巨噬细胞聚集体均达到稳定的大小（图4C）。
图4GATA6+腔巨噬细胞与血小板在激光致热损伤修复过程中的行为比较
4.GATA6+腔巨噬细胞聚集的分子机制
在体内控制腔巨噬细胞黏附并聚集在损伤部位的具体分子是什么呢？因为观察到的细胞积累发生在几分钟的时间内，所以作者首先假设黏附分子是由腔巨噬细胞组成性表达的，进而探查了腔巨噬细胞表达的典型黏附分子，例如整联蛋白，选择蛋白和免疫球蛋白（Ig）样黏附分子的表达。除了上述蛋白外，本课题还考察了CD9以及能够介导神经元黏附的淀粉样前体蛋白（APP）和引起血小板黏附的血小板反应蛋白1（THBS1）。然而，与相应的野生型或同种型对照的结果相比，这些分子的抗体阻断或基因缺失在损伤部位的巨噬细胞数量上没有显示任何明显的减少。
接下来作者考虑到腔巨噬细胞的黏附可能涉及到与细胞黏附不典型相关的分子。先前的研究表明，无论是对腹腔内过敏反应还是对感染性病原体(如大肠杆菌)，腹腔内注射肝素都能抑制巨噬细胞消失反应。在该课题的系统中，腹膜内注射肝素可显着减少无菌损伤所附着的细胞数量，但直接使用凝血酶抑制剂水蛭素和阿加曲班却不能复制这种作用（图5A）。考虑到肝素是一种大的聚阴离子，具有许多不依赖凝血酶的抗黏特性，该课题假设肝素通过中和识别带电基序的受体来抑制巨噬细胞黏附和聚集。
小鼠清除受体最初被鉴定为巨噬细胞受体，识别乙酰化低密度脂蛋白，含有清除受体富半胱氨酸(SRCR)结构域，并不加区别地结合数百种不同的聚阴离子配体。在海绵细胞中发现了SRCR超家族蛋白，估计有个含有SRCR的同源蛋白在海胆体腔细胞中表达。小鼠腹腔巨噬细胞表达四种含有SRCR的小鼠同源物，其中两种被归类为A类清除受体——巨噬细胞清除受体1(MSR1)和具有胶原结构的巨噬细胞受体(MARCO)(图5B)。为了进行比较，该课题检测了CD36，一种没有SRCR结构域的B类清除受体，其在小鼠腔巨噬细胞中表达水平与前两者相似(图5C)。CD36缺陷小鼠表现出巨噬细胞的正常聚集(图5F)，但用带负电荷的分子聚肌苷酸[poly(I)]阻断清除受体后，与阴性对照组（聚胞苷酸,[poly(C)]）相比，可显著降低损伤时巨噬细胞的聚集(图5，D和E)。此外，与各自的对照相比，MARCO或MSR1的特异性靶向显著减少了聚集细胞的数量(图5F)。根据[poly(I)]给药后的活体成像可以观察到，观察到虽然腔巨噬细胞聚集体形成的显着减少，但其对伤口的初始附着力则保持相对完整（图5D）。因此，该系统中的清除受体对腔巨噬细胞在伤口处的初步黏附是非必需的，它们在第二步，即细胞-细胞聚集体形成过程中充当次级系链。
图5GATA6+腔巨噬细胞聚集的分子机制
接下来，作者考察了由于抑制腔巨噬细胞聚集而产生的功能性后果。当巨噬细胞聚集被[poly(I)]阻断时，通过完整腹壁对腹膜的局灶性热损伤显示出愈合时间延长，这表明聚集体的形成在功能上有助于愈合过程（图6，G至J）。在未接受[poly(I)]的动物中，14天后未观察到肝或腹壁病变，愈合过程中没有出现腹腔内疤痕，因此证明了腔巨噬细胞具有完全愈合这些病变而没有疤痕表型的能力。
图6GATA6+腔巨噬细胞可完全修复通过完整腹壁对腹膜造成的局灶性热损伤
5.GATA6+腔巨噬细胞介导的病理瘢痕形成
在棘皮动物中，对体壁损伤的反应包括形成内皮细胞聚集体和局部产生胶原蛋白。对人类而言，腹部手术后经常出现腹内疤痕，表现为腹膜粘连，迄今为止缺乏有效的治疗方法，仍是尚未解决的临床挑战。因此，该课题探究了哺乳动物腔巨噬细胞在响应损伤时的聚集是否会导致腹膜粘连的形成。使用需要打开腹腔的慢性成像窗口（图7A），作者观察到巨噬细胞在几分钟之内聚集到窗口表面，形成了自由浮动的聚集体，之后聚集体开始合并并形成超级聚集体。响应于成像窗口的植入而形成的超级聚集体的尺寸高达响应于腹膜激光损伤而形成的简单聚集体尺寸的倍（图7，B和C）。接下来超级聚集体开始在成像窗口和腹内脏器（例如网膜，图7D）之间形成连结：在3天内被间皮衬层覆盖（图7E），7天后胶原蛋白沉积在这些巨噬细胞超聚集体中（图7F）。间皮的覆盖和胶原蛋白的沉积均被认为是腹膜粘连形成的标志。因此，严重的医源性腹膜腔紊乱，例如开腹手术和异物的引入，可能会导致腔巨噬细胞聚集的失调，由此形成的超级聚集体即是腹膜粘连的前体。
图7腹腔成像窗口植入后1小时显示出不受控制的巨噬细胞聚集，从而导致腹腔内结构黏附于聚集在窗口表面的巨噬细胞
为了量化具有更多临床相关性的系统中的腹膜粘连形成，该课题使用了先前描述的手术无菌损伤模型：腹膜纽扣模型在该模型中，首先划定剖腹术中线，腹膜壁的一部分（包括肌肉层和腹膜）皆被钳夹并将其底部结扎，在腹膜腔的每个象限中形成一个纽扣（图8A）。与可以在不形成疤痕的情况下治愈的局灶性热损伤相比，该模型通过剖腹手术创建缺血性囊袋和引入异物（聚丙烯缝合线），提供了更医源性的环境。该模型导致纽扣与相邻的腹腔内器官之间在7天内可重复形成腹膜粘连（瘢痕，图8B）。手术后3小时内，腹腔巨噬细胞聚集体从腹膜液募集到纽扣上（图8，C到E），当清除受体被[poly(I)]阻断时，这一过程可以减少（图8，C至E）。值得注意的是，手术后7天获得的腹膜粘连通常在用于形成腹膜纽扣的缝线处形成且充满腔巨噬细胞（尤以聚丙烯缝线处浓度最高）（图5F）。通过用[poly(I)]抑制清除受体后，腔巨噬细胞的募集受阻，在手术后7天内形成的腹膜粘连的数量和强度显着降低（图4G）。
图8抑制清除受体可降低GATA6+腔巨噬细胞在医源性腹膜损伤修复过程中的失调性募集
结论
该课题的研究结果揭示了GATA6原始巨噬细胞在血管外无菌性损伤中的血小板样作用。这种快速反应可在数分钟内将腹膜伤口封堵，并在修复小损伤（例如局灶性热损伤或激光引起的腹膜损伤）中发挥重要作用。这种局灶性损伤反映了一种类型的损伤，免疫系统已经对其发展出了有益的反应。相比之下，医源性程序（例如涉及异物植入的腹部手术）反映出一种没有进化先例的损伤。在这种情况下，腹膜腔巨噬细胞在试图修复伤口时可能会造成有害疤痕的形成。因此，巨噬细胞聚集及其被清除受体拮抗剂的抑制为我们提供了一种预防腹膜粘连的治疗靶点，具有重要的临床意义。此外，这些发现可能会扩展到其他腔，包括胸膜和心包间隙。
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