赵之聪王健东
摘要肝细胞癌（肝癌）是全球最常见的恶性肿瘤之一，肝移植是失去根治性切除机会或伴有失代偿性肝硬化肝癌患者唯一有效的治疗方法。然而肝癌肝移植术后肿瘤复发依然严重影响了患者的预后，这也是近年来肝移植领域的研究热点。微小RNA是一类真核细胞中广泛存在长度约21～23nt的非编码RNA，目前的研究认为微小RNA与肝癌肝移植术后肿瘤复发密切相关。联合应用检测微小RNA与米兰标准有可能进一步提高肝移植受者的无瘤生存期。微小RNA具有调节肿瘤细胞生物学行为的功能，可能成为肝移植术后肿瘤复发的潜在治疗靶点。本文总结了近年来微小RNA与肝癌肝移植术后肿瘤复发的相关研究，为肝移植临床医师及科研工作者提供了新的思路。
微小RNA；循环微小RNA；肝细胞癌；肝移植；米兰标准；复发；预测；治疗；甲胎蛋白（AFP）；实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）
肝细胞癌（肝癌）是最常见的原发肝脏恶性肿瘤，其发病率在恶性肿瘤中位列第5位。我国是肝癌的高发国家，每年肝癌患者的新增人数及死亡人数约占全球的50%[1-2]。肝移植是失去根治性切除机会或伴有失代偿性肝硬化肝癌患者唯一有效的治疗方法[3]。我国每年因肝癌行肝移植手术的例数约占肝移植总例数的30%～40%[4]，这一数字较国外明显偏高。米兰标准是目前国际上应用最为广泛的肝癌肝移植选择标准，符合米兰标准的肝癌患者术后5年存活率约为70%。然而，肝癌肝移植术后肿瘤复发的发生率约为5%～23%[5]，且大多数肿瘤复发出现在术后2年内，确诊肿瘤复发后的中位存活时间不超过1年[6]，极大地影响了肝癌肝移植的长期治疗效果。因此，如何预测肝癌肝移植术后肿瘤复发，尽早进行干预，延长患者的生存期是一个非常重要的课题。随着分子生物学的不断发展，目前已经发现了多种与肝癌肝移植术后肿瘤复发相关的标志物，如甲胎蛋白（AFP）、C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil/lymphocyteratio，NLR)、脱-γ-羧基凝血酶原（des-gamma-carboxyprothrombin，DCP）等[7]。近几年的研究发现微小RNA（microRNA，miRNA）在肝癌的发生发展中扮演了重要的角色，其在预测肝癌肝移植术后肿瘤复发中也有具有巨大的价值[8-9]。本文就近年来有关miRNA与肝癌肝移植术后肿瘤复发预测及防治方面的研究作一综述。
1miRNA的特性和功能
miRNA是一类在植物和动物细胞内广泛存在的短序列非编码RNA，长度约21～23nt。它可以通过与靶基因信使RNA的3’UTR端部分结合或完全互补，从而对其进行转录后的调控[10-11]。在生物体内单个miRNA可以调控不同的基因，大多数信使RNA均会受到miRNA的调节。这一严密的调控网络使得miRNA参与了生命活动中的一系列重要过程，包括早期胚胎发育，细胞的增殖、凋亡以及肿瘤的发生发展等[12]。根据其调控基因的不同，miRNA既可以表现类似于癌基因的促癌作用，也可以表现出抑癌作用，如在肝癌细胞中miR-a表达上调可以抑制细胞周期蛋白G1基因并促进肿瘤的发生，而miR-是一种具有肿瘤抑制作用的miRNA，故在肝癌组织中miR-的表达显著下降[13]。
miRNA除了存在于组织，还可以稳定存在于血清、血浆、尿液等体液中，这些存在于体液中的miRNA被称为循环miRNA（circulatingmiRNAs）。体液中的循环miRNA可以通过基因芯片、实时定量聚合酶链反应（quantitativeRT-PCR，qRT-PCR）等手段进行检测与分析。由于人体组织标本难以获得且无法连续监测，而血标本容易获得且创伤性较小，因此，循环miRNA已成为研究热点。研究发现，某些循环miRNA在肿瘤患者体液中特异性表达，故可以作为一种新型的肿瘤标志物。Tomimaru等[14]证实，肝癌患者血浆miR-21的表达水平明显高于正常对照组，且其诊断效能高于AFP。Fu等[15]发现乙型病毒性肝炎相关肝癌患者肝组织中的miR-表达下调，但血清内的miR-水平明显高于健康人群，循环miR-可以成为监测乙型病毒性肝炎相关肝癌的分子标志物。除此之外，循环miRNA在预测肝癌肝移植患者术后肿瘤复发方面也有潜在的价值，本文将在后续对其进行介绍。
2miRNA与的肝癌肝移植选择标准
选择合适的肝癌肝移植适应证是预防肝癌肝移植术后肿瘤复发的重要措施之一。目前国际上应用最为广泛的肝癌肝移植标准是米兰标准（单个肿瘤直径≤5cm；多发肿瘤≤3个且最大直径≤3cm）。尽管用米兰标准来选择肝移植患者可以提高患者的存活率和无瘤生存期，但米兰标准主要依靠影像学资料进行分析，评价的维度较为单一，且无法预测肿瘤的复发风险，故存在一定的局限性。Xie等[16]利用基因芯片技术对个肝癌组织样本进行了分析，发现肿瘤复发组中有5种miRNA表达会下调（miR-、miR-、miR-15a、miR-22、miR30a），且这5种miRNA与肝癌肝移植术后肿瘤复发之间存在较强的相关性。因此，研究人员设想，若将miRNA的表达水平与米兰标准联合应用严格选择肝移植的病例，能否进一步降低术后肿瘤复发的发生率？
Liese等[17]采用同样的技术发现了13个在肝移植后复发病例中特殊表达的miRNA，其中下调的有miR-、miR-、miR、miR-、miR-，上调的有miR-let-7d、miR-let-7i、miR-、miR-、miR-、miR-、miR-0、miR-。Cox回归分析表明miR-、miR-和米兰标准联用与肝移植术后无瘤存活状态之间存在相关性，且可以作为一项独立的肿瘤复发预测指标。此外，他们还建立了一个基于米兰标准和miR-、miR-表达水平的预测评分体系，并在一项由22例患者组成的队列研究中进行了验证。研究结果表明，miR-高表达和miR-低表达与肝癌肝移植术后肿瘤复发存在较强的相关性，该评分体系可以用来预测移植后肿瘤复发。采用miRNA联合米兰标准选择肝癌肝移植受者，能够进一步改善患者的预后，延长患者的无瘤存活期。
除了肝癌患者自身肿瘤的特征，供肝的某些生物学特性可能也会对受者预后产生影响。Xu等[18]认为移植供肝可能会给受者带来某些肝癌的易感环境，从而使受者更容易发生肿瘤复发，其研究证实了供者miR-a-2多态位点rs纯合子CC突变，会提高肝癌肝移植术后肿瘤复发的发生率，并缩短患者无瘤存活时间。与TT突变相比，多态位点rs纯合子CC突变会使miR-a过表达。动物实验表明miR-a的表达水平与肝脏内肿瘤的数量呈正相关，miR-a可能为肿瘤提供适宜生长的环境。因此，供者miR-a-2多态位点rs与肝癌肝移植术后复发密切相关。该研究首次阐明除了肝移植受者本身，供者的某些特征也会对肝癌肝移植术后肿瘤复发产生影响。过去几十年中，为了改善肝癌肝移植的效果和预后，移植科医师一直致力于优化肝癌肝移植受者的筛选标准，由上述研究可见，也应该重视对供者的检测和选择，探索出一套科学合理的肝癌肝移植供者的评价标准。
3miRNA与肝移植术后肿瘤复发的预测肝癌肝移植术后肿瘤复发的机制较为复杂，是一个多环节、多阶段的过程，目前普遍认为存在两种理论：一是残留复发，受者肝外分布的肝癌细胞在移植后会再次进入肝脏，并逐渐发展为新的肿瘤；二是新生肿瘤，由于国内大多数肝癌患者有病毒性肝炎病史，在体内众多致癌因素的作用下，受者移植后的肝细胞容易再次发生癌变[19]。无论哪种复发方式，肝细胞的微环境对肿瘤复发有着重要的作用。
Morita等[20]通过对70例肝癌肝移植受者的肝癌组织和癌旁正常组织进行miRNA表达谱的分析发现，miR-18a表达上调和miR-a-5p表达下调与术后肿瘤的复发密切相关。他们进一步证实了miR-18a的靶基因为TNFAIP3，miR-a-5p能调节HIF1A、VEGFA、IGF1R、IGF2的表达。先前的研究证实H1F1A、VEGFA高表达预示肝癌患者预后不良，而IGF1R、IGF2与肿瘤的发生发展有关。Wu等[21]收集了例肝癌肝移植患者的肝癌组织及正常组织，检测了标本中miR-5p的表达情况，发现在肝癌组织中miR-5p高表达，且miR-5p的表达水平与患者的无瘤存活期呈负相关。细胞学实验表明，miR-5p能提高肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。故对符合米兰标准的肝癌患者来说，miR-5p表达水平越低，肝移植的预后越好。Feng等[22]对例肝移植受者的肝癌样本进行研究发现，miR-a表达较低的患者预后比miR-a高表达的患者更差。他们进一步证实了miR-a可以通过调节MACC1基因的表达，从而抑制肝癌细胞的生长和转移。Tan等[23]发现肝癌肝移植术后肿瘤复发的受者中，miR-表达水平较无复发的受者低，miR-低表达受者的无瘤存活期及总体存活率均较miR-高表达受者低。多变量分析表明miR-是肝移植术后肿瘤复发的独立预测指标。Zhong等[24]采用qRT-PCR检测了例肝癌样本的miR-表达水平后，发现miR-表达与肝癌微血管侵犯密切相关，且miR-表达水平越高，患者的无瘤存活期越短。因此，miR-在复发的肝癌组织中过表达，可作为肝癌肝移植术后判断预后的分子标志。
循环miRNA在血清中可以稳定存在，且可用qRT-PCR等方式进行检测，与组织miRNA的组成相似且更易获得，因此，在研究肿瘤微环境及细胞生物学行为等方面更有价值[25]。Ng等[26]的研究发现血浆内的早期循环miRNA可以用来预测肝癌肝移植术后肿瘤复发。工作曲线分析表明，早期循环miR-a和miR-预测肝癌肝移植术后肿瘤复发的灵敏度和特异度较高，miR-还可以作为一项独立的肿瘤复发预测指标。此外，还发现循环miR-早期表达水平与肝移植受者术后天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）水平相关。体外实验发现，肝移植早期损伤诱导的巨噬细胞分化可能是miR-表达上调的原因。Sugimachi等[27]从肝癌患者血清中提取了外泌体miRNA，发现在肝移植术后肿瘤复发患者的血清中miR-表达下调。miR-能抑制肝癌细胞的增殖，其在肝癌细胞中的作用靶点为HOXB8基因。因此，血清中的外泌体miRNA也可能成为肝移植后肿瘤复发的预测标志物。
4miRNA与肝癌肝移植术后肿瘤复发的治疗
miRNA参与了肿瘤的增殖、转移、复发等众多过程。随着对miRNA的深入研究，越来越多的证据表明它可以作为肝癌治疗的潜在作用靶点。miRNA用于肿瘤治疗的主要策略为利用miRNA拮抗剂抑制致癌miRNA的表达，或增强抑癌miRNA的表达，从而限制肿瘤细胞的某些功能。Park等[28]将抑制miR-的寡核苷酸导入肝癌小鼠模型中。体外实验表明miR-抑制剂可以明显降低肝脏内的miR-表达水平，抑制肝癌细胞的增殖并且增强细胞的凋亡。miR-26a具有调控细胞周期蛋白D2、E2表达的功能，在肝癌细胞中miR-26a的表达受抑制。Kota等[29]在大鼠肝癌模型中使用腺病毒刺激miR-26a的表达，发现该方法可以抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡，且没有明显的毒性。然而，大多数关于miRNA抗肿瘤效应的研究都仅仅停留在体外实验阶段，且并未考虑miRNA对复发的肝癌细胞是否仍有治疗作用，因此miRNA的临床应用效果还需等待进一步的验证。
除了利用miRNA直接调控肝癌细胞的生物学行为外，miRNA也可以增强肝癌细胞对某些药物的敏感性，而这可能会成为晚期肝癌及肝癌肝移植术后肿瘤复发治疗的新策略。索拉非尼是一种口服多激酶抑制剂，能够有效抑制肝癌细胞的增殖及肿瘤血管的生成。国外已有多个中心推荐将索拉非尼作为肝移植术后肿瘤复发的治疗方法[30]。体外实验表明，miR-可以增加肝癌对靶向药物索拉非尼及化学药物治疗（化疗）药物多柔比星的敏感性[31-32]。最近，Xu等[33]也发现miR--3p可以通过调节MDM2/AR/FKBP5/PHLPP/pAKT-pERK信号通路，从而增加肝癌对索拉非尼的敏感性，抑制肝癌细胞的转移。Cai等[34]证实了miR-b可以通过调节Mcl-1和DPYD基因的表达，从而增强化疗药物氟尿嘧啶对肝癌细胞的作用。
5总结
分子生物学的发展为肝癌肝移植术后肿瘤复发的研究打开了新的大门。作为传统肝癌诊断标志物的AFP在肿瘤的复发预测、肝移植选择标准等方面均发挥了重要的作用。我国学者提出的肝移植杭州标准将患者的血清AFP水平纳入其中，不仅扩大了肝移植的适应人群，还达到了与米兰标准基本一致的存活率。能否借鉴AFP的临床应用，将miRNA表达水平与米兰标准联合使用，进一步扩大肝移植的适应人群并降低肿瘤复发的发生率，这是一个很有前景的应用策略。miRNA参与了众多基因的表达调控，在肿瘤的增殖、凋亡、转移等过程中均起了重要的作用。深入研究miRNA的基因调控网络有助于更好地阐述肿瘤复发的机制。与组织miRNA相比，循环miRNA更容易获得，且便于进行长期监测，有可能成为重要的肿瘤复发预测标志物。对miRNA的研究才经历了短短的十几年，已经取得了许多重大的成果，期待开展更多的临床研究，努力延长肝移植患者的存活期，早日解决肝移植后肿瘤复发这个难题。
作者单位
092上海交通大医院普外科
通讯作者：王健东，Email：wangjiandongdr
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